异丙酚对大鼠前脑缺血再灌注后海马MCP-1,CCR2表达的影响

                            侯晓来 郭永清 张华萍 郭政

【摘要】 目的 探讨异丙酚对大鼠前脑缺血再灌注后海马单核细胞趋化因子1（MCP-1）、及其受体CCR2表达的影响。方法 采用双侧颈总动脉夹闭合并放血降压再回输法建立前脑缺血再灌注模型。健康成年SD大鼠24只，体重250~300g，随机分为3组（n=8）：C组为假手术对照组(仅暴露双侧颈总动脉及股动静脉置管) ; I/R组为缺血再灌注损伤组(股静脉注射生理盐水) ; P组为异丙酚干预组(股静脉注射异丙酚50mg/kg)。分别采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫蛋白印记(Western Blot)技术检测各组大鼠前脑海马神经元中MCP-1、CCR2mRNA水平及蛋白质水平的表达变化。结果  缺血损伤组海马神经元中MCP-1、CCR2mRNA水平及蛋白质水平较假手术组显著增高（P<0.05），异丙酚干预组MCP-1、CCR2表达较缺血损伤组显著降低（P<0.05）。结论  异丙酚的脑保护作用可能与MCP-1、CCR2表达的下调有关。

【关键词】异丙酚；脑缺血再灌注；MCP-1；CCR2

Effects of propofol on hippocampal MCP-1,CCR2 expression after forebrain ischemia /reperfusion in rats  Guo yong qing  Hou xiaolai Derpartment of Anesthesiology, Hospital of Shanxi province,Taiyuan 030012 China

【Abstract】 Objective To investigate the effect of propofol on hippocampal MCP-1,CCR2 exp ression after forebrain ischemia /reperfusion ( I/R) in rats. Methods  twenty-four male SD rats weighting 250g~300g were randomly divided into three groups ( n = 8): control group (C) in which sham operation was performed; I/R group (I/R) in which bilateral common carotid arteries were clamped for 10 miniutes combined with hypotension (MAP: 35 mmHg~45 mmHg) induced by exsanguinations, then 1 ml saline was injected into the vena caudalis; propofol group ( P) in which 50 mg/kg propofol was injected into the vena caudalis after I/R. The end of 6 h reperfusion the animals were decapitated, then hippocampal tissue were obtained for detection of MCP-1,CCR2 expression by RT-PCR and Werstern blot technique. Results The expression of MCP-1,CCR2 in group I/R increased significantly compared with that in group C and P ( P < 0. 05). Conclusion Propofol can significantly inhibit the MCP-1,CCR2 expression induced by forebrain ischemia /reperfusion in rats.

【Key words】Propofol; cerebral ischemia/reperfusion injury; MCP-1；CCR2

大量文献证实异丙酚具有脑保护作用[1],其具体作用机制还未完全阐明。单核细胞趋化因子1（MCP-1）是CC型趋化因子家族的代表成员之一, 正常脑组织中MCP-1表达水平极低，在多种急、慢性脑损伤中发现MCP-1表达显著增加。在脑卒中研究中发现，缺血损伤可引起啮齿动物脑组织MCP-1蛋白与mRNA表达水平明显增高[2]。MCP-1基因过度表达可加重缺血性脑损伤[3]。本实验通过静脉注射异丙酚,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫蛋白印记(Western Blot)技术检测大鼠前脑缺血再灌注后海马神经元中趋化因子MCP-1及其受体CCR2mRNA水平及蛋白质水平的表达变化,初步探讨异丙酚对MCP-1、CCR2表达的影响,进而研究MCP-1在异丙酚脑保护中的可能机制。

材料和方法

1.    主要仪器与试剂Biometra PCR扩增仪（德国），Kodak ID型凝胶成像分析系统（美国），紫外分光光度计（日本），杜邦T21低温高度离心机（美国），超低温冰箱（美国 Forma）,DEPC(Sigma公司)，总RNA抽提试剂盒（TrizolReagent,Gibco）RT-PCR试剂盒（Takara 生物工程有限公司）。垂直电泳槽及电泳仪(美国 Hoeffer)，转移电泳槽及电泳仪，高速低温离心机(美国Hoeffer)，脱色摇床。

2.    实验动物与分组

选用SD雄性大鼠,体重250g~300g (山西医科大学生理实验动物中心提供)。随机分为3组,每组8只: C组为假手术对照组(仅暴露双侧颈总动脉及股动静脉置管) ; I/R组为缺血再灌注损伤组(股静脉注射生理盐水) ; P组为异丙酚干预组(股静脉注射异丙酚) 。各组分别采用半定量RT-PCR和Werstern-Blot检测MCP-1、CCR2 mRNA及蛋白表达。( n = 8)

3.建立前脑I/R模型

采用双侧颈总动脉夹闭合并放血降压再回输法建立前脑I/R模型[4] 。腹腔注射10％水合氯醛0.3ml/lO0g麻醉后，仰卧位固定，颈正中切口，长约3cm，逐层分离,暴露双侧颈总动脉。分离左侧股动静脉,分别置入24号套管针,动脉持续监测血压,静脉放血、补液、回血。静脉放血前15 min测血气,满足pH 7.35~7.45、PaCO2 35mmHg~45mmHg、PaO2 290mmHg~140mmHg时,缓慢放血（放血时间5min,血液肝素抗凝），使平均动脉压降至40mmHg±,用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min,造成前脑缺血。在动脉夹闭过程中,使平均动脉压维持在35mmHg~45mmHg。缺血后将血液缓慢回输完成再灌注(回输时间5min)。再次测血气，除去股动静脉套管针,结扎股动静脉,常规消毒缝合手术切口。C组仅暴露双侧颈总动脉及股动静脉置管，不做其它处理;I/R组在动脉夹夹闭双侧颈总动脉前股静脉缓慢注射生理盐水1ml; P组在动脉夹夹闭双侧颈总动脉前股静脉缓慢注射异丙酚50mg/kg。6小时后,断头取脑,-20℃冰玻上迅速剥离两侧海马组织放入冻存管,置液氮中速冻固定,然后放置在-80℃冰箱中保存。

4.RT-PCR检测MCP-1、CCR2 mRNA的表达（1）细胞总RNA的提取：称取海马组织50mg。加入1mlTrizlo，Reagent研磨成匀浆，用注射器针头抽吸10-20次成乳状。再用氯仿、异丙醇、乙醇等处理提取总RNA;(2)逆转录合成cDNA第一链：反应体积为20μl。总RNA0.5μg,7U AMV,Oligo(dT)1525pmol,20Urnase,1mmol/L dNTPs,37℃60min,　最后90℃５min灭活逆转录酶；（３）PCR扩增：反应总体积为50μl。cDNA3μl,各引物均为50pmol,dNTP0.4mmol/L,10×buffer5μl,Taq聚合酶2.5U。程序：MCP-1上游引物：5’-CTGTCTCAGCCAGATGCAGTT-3’,下游引物：5’-GAGCTTGGTGACAAATACTACA-3’,长度147bp。 CCR2上游引物5’- GTTCTCTTCCTGACCACCTTC-3’CCR2下游引物:5’-CTTCGGAACTTCTCACCAACA -3’ 长度157bp。内对照β-actin上游引物：5’-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA -3’， 下游引物：5’-AGATCCACAACGGATACATT -3’长度308bp。94℃3min一次，94℃30s，50℃30s,72 ℃1min,35个循环，最后,72 ℃5min。（４）PCR产物分析：2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后紫外灯下观察RT-PCR扩增产物（拍照）100bp的 DNA marker（TAKARA公司）为相对分子质量标准。计算机凝胶成像分析系统分析曲线下峰面积，计算出PCR产物密度含量。用MPC-1、CCR2基因扩增产物的密度与β-actin基因扩增产物的密度比值表示MPC-1、CCR2mRNA的相对表达量。

5. 免疫蛋白印记(Western Blot)技术分析法检测MCP-1、CCR2 蛋白的表达

取脑组织100 mg提取总蛋白。制备SDS—PAGE凝胶，加样电泳，待溴酚蓝电泳至分离胶底部时结束电泳。采用湿转法转膜，将PVDF膜浸入含10％ 的脱脂奶粉

辣根过氧化物酶的TBST的封闭液中，置于水平摇床上，室温封闭l h，然后用TBST清洗3次，每次5min。用TBST分别配制一抗(MCP-1、CCR2和β-actin都是小鼠抗大鼠的单克隆抗体，Santa Cruz公司产品，稀释比例都是1：1000)，将PVDF膜放入配好的抗体稀释液中，4℃过夜，TBST清洗3次，每次10 min；放入TBST配制HRP标记的二抗(抗小鼠IgG 1：10000，北京中山公司产品)室温2 h。取ECL试剂盒的A液和B液各0．5 ml，混匀后与膜于室温下作用60 s，置于x光片

盒中，曝光2~5 min，显影液显影40s，定影液定影2min，水洗10 min，晾干。将光片采用Bio-Rad 2000型凝胶成像系统扫描后，应用Quantity one软件进行吸光度分析。测定灰度值，代表蛋白的表达量。以同一标本β-actin的产物光密度值作为内参，校正各自目的蛋白的积分光密度值，计算出相对值。

统计学处理 所有数据均以 ±S表示。采用单因素方差分析，用SPSS11. 0软件进行统计分析及作图表。P<0.05为有统计学差异。

结果

实验过程中3组大鼠在血气分析上无统计学差异(P >0.05) ,实验资料略。

各组提取的脑组织总RNA A260/A280值保证在1.6~2.0之间,说明提取的总RNA纯度良好。利用选定的逆转录条件和设定的两对引物对24份标本进行检测，得到MCP-1 147bp、CCR2  157bp和β-actin308bp的扩增产物。内参照β-actin在308bp处亮度均衡，在各反应系中扩增结果基本一致，证实PCR反应基本真实地反应了MCP-1、CCR2mRNA在海马组织中的表达。在147bp、157bp处可见各组MCP-1、CCR2mRNA扩增条带，C组扩增条带亮度微弱，I组扩增条带亮度显著高于其他各组，边界清楚，P组扩增条带亮度略低于I组（图1、2）。各组光密度比值结果：C组MCP-1、CCR2mRNA呈低水平表达，I组MCP-1、CCR2mRNA表达水平明显高于C组（P<0.01）,P组较I组MCP-1、CCR2mRNA表达水平下调（P<0.05）（表1）

图1 各组MCP-1 mRNA表达                    图2 各组CCR2 mRNA表达

（M代表分子量标记物，1、2、3分别代表C、P、I/R组）

表1 三组MCP-1、CCR2mRNA在海马组织中表达的比较（n=8, ±s）

与C组比较，^＊P<0.05 ^＃P<0.01  与I组比较，^△P<0.05

各组MCP-1、CCR2蛋白表达的比较见图3。各组光密度比值结果：C组MCP-1、CCR2蛋白呈低水平表达，I组MCP-1、CCR2蛋白表达水平明显高于C组（P<0.01）,P组较I组MCP-1、CCR2蛋白表达水平下调（P<0.05）（表2）

图3 各组MCP-1、CCR2 Wersrern blot蛋白条带表达（1、2、3分别代表C、P、I/R组）

表2 三组MCP-1、CCR2在海马组织中蛋白表达的比较（n=8, ±s）

与C组比较，^＊P<0.05 ^＃P<0.01  与I组比较，^△P<0.05

讨论

　  脑缺血再灌注损伤是一种病理机制复杂的炎症损伤过程。脑缺血/再灌注后脑组织局部过度的炎症反应是造成再灌注损伤的主要原因之一[4]。研究表明,缺血再灌注后,急性期的炎症反应可加重脑组织水肿,介导继发性的脑组织损伤。在炎症反应中,脑缺血后局部炎症因子、趋化因子及黏附分子的表达是脑部缺血性损伤向炎症性损伤转变的基础[5]。

异丙酚是一种静脉全麻药,近年来对其在脑保护方面的研究较多。其脑保护机制是多途径多位点交互作用的结果,例如其抗氧化特性,可以清除自由基;抑制中枢兴奋性神经递质的释放;非选择性抑制一氧化氮合酶(NOS)的活性,降低神经系统一氧化氮(NO)含量;预防钙超载等[6]。近来有文献报道,异丙酚的脑保护机制与抑制炎症细胞和炎症反应有关。曾经有人提出丙泊酚载药脂肪乳剂可能在脑保护中发挥作用，但冯娅妮等人的研究表明丙泊酚载药脂肪乳剂对大鼠海马神经元凋亡的影响没有统计学意义[7]，故本实验未对载药脂肪乳剂进行对比研究。

在脑卒中研究中发现MCP-1的过度表达可加重缺血性脑损伤。抑制MCP-1基因表达则可减轻缺血性脑损伤。Pang等利用转化生长因子βl(transforming-

growth factorβl，TGFβl)抑制MCP-1表达，使其水平下降，经缺血处理后脑坏死面积显著减少[8]。在MCP-1基因敲除小鼠持续性大脑中动脉阻塞模型中，损伤侧坏死面积较野生型小鼠下降29%[9]。2002年，Banisadr等在成年大鼠脑组织中发现CCR2的基础性表达，广泛分布于脑神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞，经MCP-1刺激后其表达明显增加[10]。

既往研究表明脑缺血/再灌注后缺血核心区皮质内MCP-1mRNA表达于缺血后2h开始显著增加，至再灌注后6~16h达高峰，此后轻微下降，至再灌注后48h仍维持相当高的水平[11]。根据预试验结果观察大鼠模型，低血压休克状态合并脑缺血再灌注损伤10小时后，大鼠生命体征不平稳，所以该实验设计给药时间选择缺血/再灌注后6小时。给药剂量通过既往研究的异丙酚的有效脑保护浓度确定[12]。

实验结果显示：缺氧缺血脑组织中MCP-1、CCR2表达水平显著高于对照组。异丙酚干预组MCP-1、CCR2表达水平下降。己知MCP-l可与CCR2、CCR9等受体相结合， CCR2是其主要的高亲和性受体;CCR2可结合MCP-1、MCP-3，MCP-l是其主要配体[13]。脑缺血/再灌注损伤后MCP-1、CCR2表达同步增高，用药后表达同步抑制，进一步证明MCP-l参与了炎症反应的发生，同时也说明MCP-1是通过与CCR2结合而发挥其作用的。CCR2最主要的作用是结合MCP-1，趋化控制单核细胞，参与单核细胞介导的疾病。而异丙酚能明显抑制MCP-1、CCR2的表达。

MCP-1及其受体对缺氧缺血性脑损伤的发生有重要影响，这种影响是通过与其它多种免疫细胞和细胞因子相互作用，共同实现的。在复杂的细胞因子网络中探讨MCP-1及其受体的作用机制，进而寻找有效的干预措施，减轻炎症性脑损伤，应当是进一步研究的方向。由于仅为单一时间及单一药物浓度进行试验,尚无法充分阐明异丙酚对脑缺血再灌注后MCP-1表达的影响,有待于进一步研究。

综上所述,在大鼠前脑缺血再灌注损伤过程中,异丙酚可以抑制大鼠海马促炎因子，MCP-l及其主要受体CCR2的表达。通过抑制MCP-1、CCR2的表达减轻缺血再灌注后急性期的炎症反应的机制而使大鼠前脑缺血再灌注损伤减轻可能是异丙酚的脑保护机制之一。

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