缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

        郝宇华1 郭永清1  吕国义2 高春霖2

【摘要】 目的 探讨缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响。方法 成年雄性SD大鼠40只，体重250-300g，随机分为5组（n=8），①假手术组（sham组）：只进行麻醉和分离解剖两侧颈总动脉，②缺血再灌注1组（I/R1组）：给予脑缺血30min，再灌注24h，③缺血再灌注2组（I/R2组）：给予脑缺血30min，再灌注48h，④缺血后处理1组（Post1组）：给予脑缺血30min，缺血后处理后再灌注24h，⑤缺血后处理2组（Post2组）：给予脑缺血30min，缺血后处理后再灌注48h。使用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉实现脑缺血，撤去动脉夹实现再灌注。在再灌注即刻给予大鼠双侧颈总动脉松夹15s /夹闭15s，如此三次，实现缺血后处理。实验结束处死大鼠，开颅取左侧半球脑组织顶叶皮质制作脑组织匀浆，检测MDA含量和SOD活性。取右侧半球脑组织并作石蜡切片，采用TUNEL法观察大脑顶叶皮质细胞凋亡的情况。结果 与sham组相比，I/R1组、I/R2组、Post1组、Post2组MDA含量增高，SOD活性降低（P<0.05）；与I/R1组相比，Post1组MDA含量降低，SOD活性升高（P<0.05）；与I/R2组相比，Post2组MDA含量降低，SOD活性升高（P<0.05）；与I/R1组相比，I/R2组MDA含量降低，SOD活性升高（P<0.05）；与Post1组相比，Post2组MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05)。sham组可见少量凋亡细胞。与sham组相比，I/R1组、I/R2组、Post1组、Post2组凋亡指数升高（P<0.05）；与I/R1组比较，Post1组凋亡指数降低（P<0.05）；与I/R2组比较，Post2组凋亡指数降低（P<0.05）；与I/R1组相比，I/R2组凋亡指数降低（P<0.05）；与Post1组相比，Post2组凋亡指数降低（P<0.05）。结论 ①大鼠脑缺血再灌注损伤可以引起细胞凋亡；②缺血后处理对脑缺血再灌注损伤诱发的细胞凋亡有抑制作用；③缺血后处理可以抑制脑缺血再灌注引起的脂质过氧化反应。

【关键词】  缺血再灌注；  缺血后处理；  超氧化物歧化酶；  丙二醛；  细胞凋亡

The effects of postconditioning on cerebral ischemic/reperfusion injury in rat cerebrum

HAO Yu-hua*, LV Guo-yi, GAO Chun-lin, et al. Department of anesthesia, Shanxi People′s Hospital, Shanxi 030001, China

【Abstract】Objective To investigate the effects of postconditioning on brain apoptosis of the SD rat induced by brain ischemic/reperfusion and its mechanism. Brain tissue homogenate were collected to measure the content of MDA and the activity of SOD. Discussing the brain-protective mechanism of postconditiong and the potential clinical application. Methods Forty male SD rats weighting 250-300g were anesthetized by 10% chloral hydrate peritoneal injection. Rats were randomly divided into five groups：(1)The sham group; (2)ischemic/reperfusion 1 group：brains were subjected to 30mins of ischemia followed by 24 hours of reperfusion(I/R1 group);(3)ischemic/reperfusion 2 group： brains were subjected to 30mins of ischemia followed by 48 hours of reperfusion(I/R2 group);(4) postconditioning 1 group：brains were subjected to 30mins of ischemia followed by three circles of  15s/15s’postconditioning and 24 hours of reperfusion(Post1 group);(5) postconditioning 2 group: brains were subjected to 30 mins of  ischemia followed by three circles of  15s/15s’postconditioning and 24 hours of reperfusion(Post2 group). All of the groups were assigned 8 rats. Bilateral common carotid artery were dissociation and occlusion for 30min followed by reperfusion or reperfusion plus postconditioning. At the end of the experiment, all of the rats were killed. The brain tissue homogenate were collected in order to measure the content of MDA and the activity of SOD. Brain tissue were stored in 10% formaldehyde solution，followed by paraffin section and measurement of the apoptosis index. Results In I/R1、I/R2、Post1、Post2 groups，MDA were higher than in sham group, SOD were lower than in sham group(P<0.05). Comparing the SOD, the Post1 group and Post2 group were respectively higher than in I/R1 group and I/R2 group(P<0.05); comparing the MDA ,the Post1 group and Post2 group were respectively lower than in I/R1 group and I/R2 group(P<0.05).Comparing the SOD, the I/R2 group and Post2 group were respectively higher than in I/R1 group and Post1 group(P<0.05); comparing the MDA, the I/R2 group and Post2 group were respectively lower than in I/R1 group and Post1 group(P<0.05). In the sham group, there was low level apoptosis, while in I/R1、I/R2、Post1、Post2 groups，the apoptosis were obviously. The apoptosis index in Post1 group and Post2 group were respectively lower than in I/R1 and I/R2 group (P<0.05). The apoptosis index in I/R2 group and Post2 group were respectively lower than in I/R1 and Post1 group (P<0.05).Conclusion (1)The ischemic/reperfusion of brain could induce brain cell apoptosis; (2)Postconditioning could inhibit brain cell apoptosis induced by brain’s ischemic/reperfusion; (3)Postconditioning could inhibit lipid peroxidation reaction induced by brain’s ischemic/reperfusion.

【Key words】ischemic/reperfusion; postconditioning; apoptosis; malonaldehyde; superoxide dismutase

脑组织的缺血—再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是一种常见的病理生理现象，多发生于颅脑手术、颅脑外伤、休克、颈动脉手术、以及脑血管病介入治疗过程中。脑组织I/R损伤被认为是影响脑组织缺血性疾病病人预后的重要原因，轻则影响功能，重则危及生命。因此，探寻防治脑组织的I/R损伤策略一直是近年来缺血再灌注研究领域的热点问题。近年来，出现了一系列的方式方法来预防与治疗I/R损伤，包括缺血预处理^[1]、缺血后处理^[2]、药物预处理等。其中缺血后处理的脑保护机制研究的较少。本文通过将缺血后处理作用于I/R 脑组织，通过检测脑组织匀浆中丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、以及顶叶皮质神经元的凋亡来研究缺血后处理潜在的脑保护作用。

                            材料与方法

动物选择与分组 成年雄性SD大鼠40只（中国医学科学院放射医学研究所提供），体重250-300g，随机分为5组（n=8），①假手术组（sham组）：只进行麻醉和分离解剖两侧颈总动脉，②缺血再灌注1组（I/R1组）：给予脑缺血30min，再灌注24h，③缺血再灌注2组（I/R2组）：给予脑缺血30min，再灌注48h，④缺血后处理1组（Post1组）：给予脑缺血30min，缺血后处理后再灌注24h，⑤缺血后处理2组（Post2组）：给予脑缺血30min，缺血后处理后再灌注48h。使用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉实现脑缺血，撤去动脉夹实现再灌注。在再灌注即刻给予大鼠双侧颈总动脉松夹15s /夹闭15s，如此三次，实现缺血后处理。

动物模型的制备 大鼠术前12小时禁食，自由饮水。10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3ml/100mg）。颈部正中纵形切口，约2cm，分离浅、深筋膜及颈部肌群，暴露颈部正中气管，在气管背侧左右两侧分离见血管神经鞘，分离两侧颈总动脉及与之伴行神经。用无创动脉夹夹闭两侧颈总动脉实现脑缺血，缺血30分钟后，I/R1组、I/R2组撤去动脉夹实现再灌注，Post1组、Post2组撤去动脉夹恢复血流15秒后再行夹闭两侧颈总动脉再缺血15秒，如此三次，实现缺血后处理，其后行再灌注。以上各组均于实现再灌注后缝合颈部肌肉及皮肤，放回鼠笼饲养。I/R1组、Post1组和I/R2组、Post2组大鼠分别于再灌注24小时和48小时后处死取脑组织作细胞凋亡与MDA、SOD检测。Sham组于分离出颈总动脉后30分钟处死，开颅取脑作同上检测。

SOD活性、MDA含量、细胞凋亡的检测 在实验设计的时间点开颅取大鼠脑组织，取左侧半球脑组织顶叶皮质制作匀浆并且离心取上清液，进行SOD活性与MDA含量的检测。 SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA含量的测定采用硫代巴比妥法。取右侧半球脑组织用预冷的生理盐水冲去残血，置于10%的甲醛中固定做石蜡切片，进行细胞凋亡检测。检测方法采用改良的末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated uridine nucleotide end labelling ,TUNEL 法）。于皮质区光镜观察，随机计算5个高倍视野下凋亡细胞数占神经元总数的百分比，得细胞凋亡指数（apoptotic index）。

统计学处理  采用SPSS15.0统计学软件进行分析：计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），均数间两两比较采用Student-Newman-Keuls法进行检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

                             结    果

与sham组相比，I/R1组、I/R2组、Post1组、Post2组MDA含量增高，SOD活性降低（P<0.05）；与I/R1组相比，Post1组MDA含量降低，SOD活性升高（P<0.05）；与I/R2组相比，Post2组MDA含量降低，SOD活性升高（P<0.05）；与I/R1组相比，I/R2组MDA含量降低，SOD活性升高（P<0.05）；与Post1组相比，Post2组MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05)。sham组可见少量凋亡细胞。与sham组相比，I/R1组、I/R2组、Post1组、Post2组凋亡指数升高（P<0.05）；与I/R1组比较，Post1组凋亡指数降低（P<0.05）；与I/R2组比较，Post2组凋亡指数降低（P<0.05）；与I/R1组相比，I/R2组凋亡指数降低（P<0.05）；与Post1组相比，Post2组凋亡指数降低（P<0.05）。

五组之间MDA含量、SOD活性及凋亡指数的比较 ( ±s,  n=8)

  与sham组比较，^* P<0.05；与I/R1组相比，^# P<0.05；与I/R2组相比，^△ P<0.05；与I/R1组相比，^▲ P<0.05；与I/R2组相比，^▽ P<0.05.

                             讨    论

临床上，缺血性脑血管病比较常见，造成脑组织血流量减少，导致缺血性损伤，而持久性缺血必然造成细胞坏死或者凋亡；及早恢复脑血流灌注尤为重要，但是再灌注具有双重效应：一方面，恢复血流灌注可以使缺血脑组织的功能结构得到修复，缓解病情；另一方面，部分患者恢复血流灌注后缺血性损伤不但没有得到缓解，缺血脑组织的代谢障碍、结构破坏进一步加重，即所谓的脑缺血再灌注损伤。

脑缺血动物模型：全脑缺血动物模型；局灶性脑缺血动物模型；不完全性全脑缺血动物模型^[3]。本试验基于试验设计的特点，尤其是缺血后处理在麻醉领域中的应用，不会涉及局灶性脑缺血。全脑缺血动物模型要么干扰其它器官组织的血流灌注，要么需要二期手术，成功率低，干扰因素较多，因此亦未选择。不完全性脑缺血模型虽缺血不彻底，但是操作简单，成功率高。另外，有试验证实缺血30min即可对脑组织起到损伤作用，因此本试验选择了不完全性的全脑缺血动物模型。

实验观察时间点的选择：根据以往的试验，不完全性脑缺血动物模型的缺血脑组织在再灌注后1h、3h细胞凋亡不明显，6h后观察到细胞凋亡持续增加，24h达高峰，其后细胞凋亡的水平开始降低。因此本试验观察细胞凋亡高峰时缺血后处理组与缺血再灌注组细胞凋亡的发生情况，以及再灌注后期即再灌注48h时后处理组与缺血再灌注组细胞凋亡的区别。

实验观察部位的选择：在缺血缺氧条件下，海马CA1区、纹状体、大脑皮质等对缺血缺氧敏感的区域，易于发生细胞凋亡、程度也相对严重；而对缺血缺氧不太敏感的脑干等区域不易发生细胞凋亡，即使发生，程度也相对轻。因此，本试验选取了大鼠大脑的顶叶皮质作为细胞凋亡的观察部位。

缺血再灌注对脑组织的影响：大量的研究表明,脑组织的缺血再灌注引起氧化应激、炎症反应、以及神经元的凋亡。活性氧（reactive oxygen species，ROS）在再灌注的最初几分钟内爆发生成^[4]，引发的氧化损伤是脑组织缺血再灌注损伤的主要原因之一。机体自身具有一整套完整的抗氧化酶系统，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），过氧化氢酶（catalase，CAT）等。正常情况下，ROS可为上述抗氧化酶系统清除。在缺血再灌注过程中，体内ROS大量生成，同时机体抗氧化酶系统功能下降，氧化能力大大超过抗氧化能力而发生氧化应激，从而直接引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性，DNA损害，最后导致细胞死亡。通过减少ROS的产生和保护机体的抗氧化酶系统是抗脑组织缺血再灌注损伤的主要策略。神经元凋亡是脑缺血再灌注损伤的重要形式之一^[5]，特别在迟发性神经元损害阶段^[6]。Li^[7]等在局灶性和全脑缺血动物模型中观察到了神经元凋亡的现象。

脑缺血时脑组织的血流量减少，脑组织严重缺氧，氧自由基清除酶的活性下降，氧自由基生成增多。脑组织由于含有大量不饱和脂肪酸，对氧自由基介导的脂质过氧化反应尤为敏感，因此脑神经元细胞膜受到攻击，产生大量过氧化脂质，其中丙二醛（malonaldehyde，MDA）即为一种主要的脂质过氧化产物，它破坏细胞膜的通透性并导致一系列的细胞膜结构和功能的损伤。MDA作为一种氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量变化间接反映了组织中氧自由基的含量与组织细胞的损伤程度。本实验通过检测脑组织匀浆中丙二醛含量反映脑组织缺血缺氧后脂质过氧化水平。在对照组，MDA含量较低，而在I/R1组、I/R2组MDA含量较对照组显著增高（P<0.05）。可见：在对照组，脑组织脂质过氧化水平较低，与组织中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化成分处于平衡状态；缺血再灌注导致ROS的迅速大量产生，引起脂质过氧化水平增强，氧化与抗氧化平衡被打破，偏向了过氧化一侧，过氧化产物MDA增加，继而产生一系列损伤。MDA在Post1组、Post2组的含量较对照组有显著增高（P<0.05）；但Post1组与I/R1组、Post2组与I/R2组相比，MDA的含量明显的降低(P<0.05)。可能原因是：缺血后处理通过再灌注开始阶段控制性再灌注减弱了ROS的爆发产生，继而减弱脑组织脂质过氧化水平，起到了减轻组织损伤，改善预后的作用。I/R2组与I/R1组、Post2组与Post1组相比，MDA的含量均明显的降低（P<0.05），可以这样解释：机体在缺血缺氧引起脂质过氧化情况下，通过调动机体内源性机制，增加超氧化物歧化酶及谷胱甘肽等抗氧化物的产生及活性，对抗了脂质过氧化反应，使脂质过氧化的产物MDA含量伴随着时间推移而降低。因此，缺血后处理在一定程度上通过减轻脂质过氧化反应起到脑组织的保护作用。

SOD作为一种自由基清除剂，对机体的氧化抗氧化平衡起重要作用。正常状态下，组织中具有一定水平的SOD，以对抗基础状态的脂质过氧化，以达到氧化与抗氧化的平衡。本实验检测了各组大鼠脑组织中SOD活性，其中对照组SOD活性最高，I/R1组、I/R2组SOD活性较对照组明显降低（P<0.05）。可见：在对照组，氧化与抗氧化处于均势，因而SOD具有高活性；缺血再灌注导致I/R1组、I/R2组脂质过氧化水平的增强，在一定程度上消耗了组织的抗氧化储备,因而SOD活性与对照组相比减低。在Post1组、Post2组，SOD活性与对照组相比明显减低（P<0.05）；但较I/R1组、I/R2组，SOD活性有所提高（P<0.05）。可能原因：缺血后处理通过增强脑组织中SOD的活性，对抗组织过氧化反应；或是减轻脂质的过氧化，减少了自由基清除剂SOD 消耗，实现了SOD的高活性，继而发挥对抗过氧化反应的良性循环作用，以发挥对组织器官的保护作用。I/R2组与I/R1组、Post2组与Post1组相比，SOD活性升高（P<0.05），可以解释为：机体调动内源性的对抗脂质过氧化的保护机制，通过增强SOD与过氧化氢酶的合成，使SOD活性随着时间的推移得到了增强。因此：缺血后处理在一定程度上通过增强抗氧化物SOD的活性起到对脑组织的保护作用。

缺血后处理减轻脑组织缺血再灌注导致的脂质过氧化作用和减少超氧阴离子产生的可能机制：①缺血后处理限制了底物氧分子的运输，因而直接的削弱了ROS的产生；②缺血后处理延缓了细胞自身分泌的活性物质如腺苷和一氧化氮的流出与释放模式，从而减少了中性粒细胞或其它细胞来源的活性氧的产生^[8]；③缺血后处理使再灌注初期过度灌注时间缩短、流量减小，减少了活性氧簇的过度产生^[9]。因此缺血后处理极可能是通过减轻再灌注早期ROS的产生，保护机体的抗氧化酶功能发挥抗缺血再灌注损伤的作用。

本实验检测了各组大鼠大脑皮质神经元凋亡的发生情况：在sham组，细胞凋亡少量发生，在I/R1组、I/R2组细胞凋亡较sham组增强（P<0.05）；在Post1组、Post2组细胞凋亡亦较sham组增强(P<0.05)；但是Post1组与I/R1组、Post2组与I/R2组相比细胞凋亡降低(P<0.05)。可见：生理状态下存在细胞凋亡；缺血再灌注进一步加剧了细胞凋亡的发生，通过在再灌注的一开始给予缺血后处理，细胞凋亡水平较单纯缺血再灌注组明显降低。因此，缺血后处理可能是通过减少缺血缺氧组织的细胞凋亡发挥其保护作用的。Post2组较Post1组、I/R2组较I/R1组细胞凋亡的水平显著的降低（P<0.05）：可能源于缺血缺氧引起的脑皮质神经元的凋亡高峰出现于再灌注后24h，其后随着时间的推移而减少。生物学机制为：单个细胞凋亡后相邻的上皮细胞、巨噬细胞可以吞噬凋亡小体，并在溶酶体中消化降解、细胞凋亡发生很快，持续2-4h^[10]。细胞凋亡的机制为：在再灌注的早期阶段，活性氧簇的过量产生触发了位于线粒体内膜的非特异性线粒体通透性转换孔的开放，导致了跨膜电位的消失，呼吸链的解偶联，细胞色素C及其它促凋亡因子的外流，最终导致细胞坏死或者凋亡。缺血后处理可能是通过抑制线粒体通透性转换孔的开放起到对抗缺血再灌注损伤的作用^[11]。

综上所述，缺血后处理通过抑制脑组织的缺血再灌注损伤诱导的神经元胞凋亡以及脂质过氧化反应起到对脑组织的保护作用。基于缺血后处理可以在缺血发生后实施，不必像预处理那样需预知缺血事件的发生，其在将来可能用于脑组织缺血再灌注损伤的保护过程中，起到改善预后的作用。

                        参  考  文  献

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